Almost two decades after sequencing the human genome, understanding the complex genetics of quantitative phenotypes remains a major challenge in biology and medicine. This is in large parts due to extensive redundancies, synergisms and context-dependent gene functions. Whilst recent efforts to map all genetic interactions (GIs) in yeast produced unprecedented biological insights, similarly comprehensive approaches in human cells lack feasibility so far, mainly due to (i) the large size of the human genome and (ii) limitations inherent to genome perturbation methods. Exploiting new library generation technologies, which we developed to increase CRISPR screening scalability, we propose here to perform comprehensive SpCas9-based mapping of genetic interactions in human cells. We will use ~34 million pairwise gRNA combinations to perturb 4.2 million human gene pairs in cellular models of colon, lung and pancreatic cancer, the three leading causes of cancer-related death in Western countries. To facilitate data interpretation and downstream functional work, we will focus our surveys on important cancer pathways (WNT, RAS, ubiquitin) and on clinical challenges (druggable genome), which are key areas of expertise in the three applicant laboratories. We will harness GI profiling for biological discovery and therapeutic target identification at multiple levels. First, genome-wide combinatorial surveys for GIs involving the WNT, RAS, and ubiquitin systems will give new insights into the composition and functional organization of these key oncogenic pathways. We will identify new pathway components, dissect synergisms, redundancies and hierarchies within pathways, uncover signaling modulators as well as cross-talk between pathways. Second, we will exploit GI mapping combined with analysis of interaction profile similarity to predict the participation of genes in signaling pathways or cellular processes. Coupled with spatial enrichment analyses of biological processes in networks, these efforts will systematically annotate the function or uncharacterized genes and predict novel function for known genes in an unbiased manner. Third, we will validate GIs across large cell line panels and entities to systematically explore molecular and cellular context-dependencies, ultimately aiming at better understanding tissue-specific differences in tumorigenesis and the organization of signaling pathways. Finally, our screens will probe more than one million interactions involving FDA-approved drug target genes across entities. We aim at uncovering new avenues to indirectly target undruggable mutations, as well as new synthetic vulnerabilities for combinatorial drug repurposing, which we will test in preclinical models. Our proposed project represents the largest genetic interaction screening effort in human cells to date. It promises to give multifaceted insights into the biological underpinnings of human cancer and to uncover new avenues for therapeutic intervention.
Zwei Dekaden nach Sequenzierung des humanen Genoms, bleibt das Verständnis der Genetik quantitativer Phänotypen eine der größten Herausforderungen in der Biologie und Medizin. Dies liegt in weiten Teilen an Redundanzen, Synergismen und Kontextabhängigkeiten von Genfunktionen und ihrer Effekte. Während die Kartierung aller genetischen Interaktionen (GI) in der Hefe vor kurzem vielschichtige neue biologische Einblicke gebracht hat, sind ähnlich umfassende Ansätze beim Menschen bisher nicht möglich, v.a. wegen (i) der Größe des humanen Genoms und (ii) methodischer Limitierungen der Genomperturbation. Wir schlagen vor, von uns entwickelte neue Technologien zur Erstellung von CRISPR Bibliotheken einzusetzen, um umfassende SpCas9-basierte Kartierung von genetischen Interaktionen in humanen Zellen durchzuführen. Durch genetische Screens mit ~34 Mio gRNA Kombinationen werden wir 4.2 Mio Genpaare in zellulären Modellen von Kolon-, Lungen- und Pankreastumoren perturbieren. Wir werden unsere Untersuchungen auf wichtige Krebssignalwege und therapeutische Angriffsziele konzentrieren, die zur Kernexpertise der antragstellenden Gruppen gehören. Auf multiplen Ebenen wird systematisches GI-„Profiling“ eingesetzt, um biologische Zusammenhänge zu entdecken und neue Ansätze in der Krebstherapie aufzuzeigen. Genom-weite kombinatorische Screens mit Genen der WNT, RAS und Ubiquitin Systeme werden neue Einblicke in deren Komposition und funktionelle Organisation geben. Wir werden neue Pathway-Komponenten entdecken, Synergismen, Redundanzen und Hierarchien innerhalb der Signalwege aufzeigen, neue Signalweg-Modulatoren identifizieren und „inter-pathway“ Kommunikation aufdecken. Nachfolgend werden wir GI-Kartierung und „Interaction Profile Similarity“-Analysen einsetzen, um die Partizipation von Genen in bestimmten Signalwegen oder zellulären Prozessen vorherzusagen. Gekoppelt mit Netzwerkanalysen werden diese Arbeiten die Funktion bisher nicht charakterisierter Gene annotieren, sowie neue Funktionen für bekannte Gene aufdecken. Desweiteren werden wir GIs über Organgrenzen hinweg in großen Zelllinienkollektionen validieren, um molekulare und zelluläre Kontextabhängigkeiten aufzudecken. Die Ambition hierbei ist, gewebsspezifische Unterschiede bei der Tumorentstehung und der Organisation von Signalwegen besser zu verstehen. Schließlich werden unsere Screens mehr als eine Million kombinatorische Perturbationen mit Targetgenen von „FDA Approved Drugs“ interrogieren. Wir beabsichtigen neue Wege des indirekten Targeting von „undruggable“ Mutationen aufzudecken, sowie synthetische Vulnerabilitäten für „Drug-Repurposing“ zu identifizieren, die wir in präklinischen Modellen testen können. Das vorgeschlagene Projekt ist der bei weitem größte Ansatz zur Kartierung von genetischen Interaktionen weltweit. Es verspricht vielschichtige Einblicke in die biologischen Grundlagen humaner Tumoren zu geben und neue Wege für therapeutische Interventionen aufzudecken.
